分子雜交爐在分枝桿菌原位雜交方面的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)背景

　　對(duì)分枝桿菌來說，因細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，阻礙了其在人和動(dòng)物結(jié)核病診斷上的應(yīng)用。選取已報(bào)道的布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌16sRNA探針，通過改進(jìn)樣品處理方式、優(yōu)化雜交條件，進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作步驟，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株和組織樣品，對(duì)探針的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終建立了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的“兩病”熒光原位雜交診斷方法。

實(shí)驗(yàn)步驟

　　將冷凍保存的布魯氏菌株接種于布魯氏菌液體培養(yǎng)基(BBL)，37℃培養(yǎng)2d;牛、禽結(jié)核分枝桿菌接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4周;回收培養(yǎng)物，PBS洗一遍，然后加入1% PFA溶液，混勻，4℃冰箱過夜。以上操作須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，F(xiàn)PA固定后的步驟可在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

　　將固定后的菌液用PBS洗兩遍，然后涂布于載玻片上，風(fēng)干待檢。對(duì)布魯氏菌，依次在30%、70%、100%乙醇中處理5 min，然后置陰涼處自然風(fēng)干;加200μL雜交液，45℃雜交1.5~4h;用44℃預(yù)熱的洗滌液洗滌2 min，雙蒸水沖洗后，滴加抗熒光淬滅封片劑，鏡檢。對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌，把樣品在二甲苯中作用10~20 min后，依次在100%、70%、30%乙醇和PBS緩沖液中處理5min，用溶菌酶(1mg/mL)和消色肽酶(30U/mL)消化20min，然后分別在PBS以及30%、70%、100%乙醇中處理5min，風(fēng)干;滴加雜交液，使用分子雜交爐(LF-IIIA，寧波新芝)于45℃雜交4 h，用37℃預(yù)熱的洗滌液洗滌20min，最后封片鏡檢。對(duì)組織研磨液，短暫離心，取上清，PFA固定后涂片。對(duì)痰液樣品，先涂片，再用PFA固定，雜交過程與上相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

布魯氏菌???：雜交前，對(duì)布魯氏菌無需特別處理，45 ℃雜交1.5 h即出現(xiàn)紅色熒光信號(hào)，200倍放大下觀察，清晰可見(圖1-A、B)。雜交3 h可完全滿足檢測(cè)需要，延長(zhǎng)時(shí)間至8 h或12 h，信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)明顯增加，因而布魯氏菌熒光原位雜交簡(jiǎn)便、快速，可在4 h內(nèi)完成。Bru-996探針與布魯氏菌S2、A19、Rev.1疫苗株和HN6、XJ-1分離株，均產(chǎn)生雜交信號(hào)，在牛結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核分枝桿菌和大腸桿菌中沒有觀察到熒光信號(hào)，表明該探針具有較高的特異性。從5個(gè)已知布魯氏菌病羊組織病料(2個(gè)肝臟、2個(gè)脾臟、1個(gè)胎盤)中均成功檢測(cè)到布魯氏菌(圖1-C)，證明該方法具有較高的敏感性。在高倍放大下觀察，布魯氏菌呈短桿菌，小于大腸桿菌(圖1-D)。

牛結(jié)核分歧桿菌???牛結(jié)核分枝桿菌樣品雜交前，須用二甲苯和溶菌酶處理（也可使用消色肽酶，但非必須），二者缺一不可。二甲苯需處理至少20 min，溶菌酶需消化30 min，以充分去除表面的酸類物質(zhì)，從而獲得充分的通透性，便于探針進(jìn)入并與RNA雜交。45 ℃雜交4 h，可獲得最佳效果，縮短雜交時(shí)間會(huì)影響信號(hào)強(qiáng)度。因此，牛結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需6~8 h。從牛肺臟結(jié)核結(jié)節(jié)研磨液上清中，成功檢測(cè)到牛分枝桿菌（圖2-A），經(jīng)抗酸染色檢出較多的抗酸菌（圖2-B）。結(jié)核病陽性牛鼻腔拭子中，未檢出典型的牛結(jié)核分枝桿菌。

　　本研究建立了布魯氏菌與結(jié)核分枝桿菌的熒光原位雜交快速檢測(cè)方法。針對(duì)布魯氏菌優(yōu)化后實(shí)現(xiàn)4小時(shí)精準(zhǔn)檢測(cè)，Bru-996探針特異性強(qiáng)，可檢出臨床組織樣本中病原體;牛結(jié)核分枝桿菌通過二甲苯脫脂與酶解預(yù)處理突破細(xì)胞壁屏障，6-8小時(shí)完成檢測(cè)，與抗酸染色結(jié)果一致。該方法操作安全高效，為布魯氏菌病和結(jié)核病的臨床診斷提供了可靠技術(shù)支撐。